El presente estudio se basó en un contacto indirecto de los cementos y las células, basado en la técnica empleada por Camps y cols.,²² (Figura 1). Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Europea (Nº de referencia CIPI/19/139). Para ello, se seleccionaron 36 (N=36) incisivos centrales superiores humanos extraídos por razones periodontales. Se excluyeron aquellos que presentaron ápices abiertos, fisura, caries, reabsorciones, calcificaciones o tratamiento endodóntico previo. A continuación, se eliminó la corona a nivel apical de la unión amelocementaria mediante discos (0,25mm, Dynex Brillantmounted, Renfert Gmbh, Hilzingen, Alemania) montados en una pieza de mano (KaVo E10C 1:1, KaVo Dental, Biberach, Alemania). Durante el estudio, los dientes se almacenaron en tamón fosfato salino con antibiótico (100 U/ mL de estreptomicina y penicilina).

Cultivo celular

Los fibroblastos L-132 se cultivaron en un medio de cultivo (Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)) complementado con antibiótico (1% de penicilina y 1% de estreptomicina), 2mM L-glutamina y 10% de suero fetal bovino (SFB, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 2500 células/cm2 cuando se cultivaron durante 24 y 48 horas, y a 2000 células/cm2 cuando se cultivaron durante 72 horas, en ambos casos a 37ºC en una atmósfera húmeda al 95% de aire y 5% de CO2 . El medio se renovó cada tres días y las células se subcultivaron cada semana en una proporción de 1 a 20 por tripsinización (0,25% Trypsin-EDTA).

Preparación de los dientes

Se confirmó la permeabilidad de los dientes, se fijó una longitud de trabajo a 0,5 mm del foramen con una lima K (ISO#10, Dentsply Maillefer, Tulsa, OK, USA) y se instrumentaron con limas Reciproc® R40 (VDW GmbH, Munich, Germany) montadas en el motor VDW Silver® Reciproc® (VDW GmbH, Munich, Germany) (Figura 1A). Durante la instrumentación, llevó a cabo la irrigación con agua destilada con antibiótico (estreptomicina, penicilina) seguida de una activación final con el sistema EndoActivator® (Dentsply Tulsa Dental Specialties, Tulsa, OK).

Contacto indirecto entre los fibroblastos L132 y los cementos

Los dientes fueron esterilizados durante 35 minutos a 105ºC en un autoclave^22,23 y distribuidos aleatoriamente en tres grupos: grupo A, AH Plus Jet® (Dentsply DeTrey GmbH, Konstanz, Germany); grupo B, BioRoot® RCS (BR, Septodont, Saint-Maur-des-Fosses, France); y grupo C, Nano-ceramic Sealer® (B&L Biotech, Fairfax, VA, USA). Los cementos se prepararon en condiciones estériles, dentro de una campana de flujo laminar (Telstar Bio II Advance Plus®, Terrasa, España), siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez mezclados, se introdujeron en una jeringa de insulina de 1 ml (BD Plastipak®, BD™). 2µl de cada cemento se introdujeron en el conducto, llevando a cabo la obturación mediante la técnica de condensación lateral (Figura 1B). A continuación, los dientes preparados se introdujeron en un microtubo (Figura 1C) y se añadieron 1,2 ml de DMEM de tal manera que sólo las porciones apicales de los dientes estuviesen en contacto con el medio (Figura 1D).

Obtención de los medios acondicionados de los cementos

En este punto, se llevó a cabo una modificación del estudio de Camps y cols.,²². Tras 24 horas de incubación, se obtuvieron medios acondicionados del primer período (0-24 horas) (Figura 1E1). A continuación, los microtubos se rellenaron con 1.2 mL de DMEM. Tras las siguientes 24 de incubación, se obtuvieron los medios acondicionados del segundo periodo (24-48 horas) (Figura 1 E2). El proceso se repitió para obtener los medios acondicionados del tercer período (48-72 horas) (Figura 1 E3). Para reducir la variabilidad individual entre las muestras, los medios de cada cemento obtenidos en cada período se agruparon en tubos Falcon. La relación superficie/medio fue de 0,5 cm/mL, estando dentro de los límites de la ISO para este tipo de estudio²³.

Evaluación de la citotoxicidad

Los 200 µL de DMEM de la placa de 96 pocillos sembrada con los fibroblastos fueron reemplazados por los medios acondicionados de los tres períodos e incubados durante 24 horas a 37ºC y 5% de CO2 . La viabilidad celular fue evaluada mediante el ensayo del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolio (MTT) (Sigma Chemical Company, St Louis, MO). Los medios acondicionados fueron retirados y reemplazados por MTT e incubados durante 4 horas a 37ºC y 5% de CO2 . Tras el periodo de incubación, se retiraron los sobrenadantes y se añadió dimetil sulfóxido a cada pocillo. La absorbancia se midió utilizando un lector de microplacas (SPECTROstar® Nano, Offenburg, Alemania) a 570 nm y 690 nm (para la muestra y el fondo, respectivamente). Los controles con el medio DMEM se tomaron como control positivo con 100% de biocompatibilidad.

Respuesta inflamatoria

Para determinar si la citotoxicidad de los cementos estaba mediada por un proceso inflamatorio, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con los medios acondicionados de los tres periodos evaluados. Como control positivo de la inflamación, las células fueron tratadas con TNF-α a una concentración de 10 ng/ mL. Tras 24 horas, se recogieron los sobrenadantes en los cuales, se determinaron los niveles de IL-6 mediante ELISA (Peprotech, Rocky Hill, NJ, EE.UU.) y los niveles de nitrito, como medida indirecta de la liberación de óxido nítrico al medio de cultivo, mediante el protocolo descrito por Nussler y cols.,²⁴.

Análisis estadístico

Para realizar el análisis estadístico, se utilizó el software SPSS 22.0 (IBM Corp, ArmonK, NY, EE.UU.). Se determinaron como variables los cementos y el tiempo. Se utilizó el análisis de la varianza (ANOVA) bifactorial para evaluar la citotoxicidad de los tres cementos en los tres períodos. Se utilizó la prueba de Bonferroni para las comparaciones post-hoc. La significación estadística se estableció para valores de p ≤ 0,05.

Evaluación de la citotoxicidad

Los resultados indican que todos los cementos presentaron algún grado de toxicidad con una tendencia decreciente a lo largo del tiempo (Figura 2). El ANOVA bifactorial reveló diferencias significativas para cada período entre los cementos. En el primer período, el Nano-ceramic Sealer® presentó el nivel más bajo de citotoxicidad (P<0,005). En el segundo período, el AH Plus Jet® presentó los niveles más altos de citotoxicidad (P<0,008), mientras que en el tercer período de evaluación (48-72 horas) sólo el grupo BioRoot® RCS presentó una ligera toxicidad (P<0,001).

Respuesta inflamatoria

Los resultados mostraron que ni el AH Plus Jet® ni el Nano-ceramic Sealer® indujeron un proceso inflamatorio, mientras que el grupo BioRoot® RCS presentó un ligero aumento de los niveles de IL-6 en el entorno celular en los tres tiempos de evaluación (Figura 3). En cuanto a los niveles de nitrito, no se detectaron aumentos en el medio, ni siquiera cuando las células fueron estimuladas con TNF-α (Figura 3).

En el presente estudio se analizó la respuesta de los fibroblastos L-132 a los cementos a base de silicatos BioRoot® RCS y Nano-ceramic Sealer®, comparándolos con el cemento de resina AH Plus Jet®. Los resultados rechazaron la hipótesis nula para el análisis de la citotoxicidad y rechazaron de forma parcial la hipótesis nula para la respuesta inflamatoria. Al evaluar la citotoxicidad en los distintos períodos y la IL-6, se observaron diferencias significativas entre los cementos, sin embargo, no se observaron diferencias entre las respuestas inflamatorias con respecto al análisis de los nitritos.

Aunque los cementos sólo deben utilizarse en el interior de los conductos¹², algunos de sus componentes podrían llegar a los tejidos periapicales¹⁷. El modelo seleccionado para el presente estudio se basó en la “técnica de inmersión en la raíz”²², ya que reduce la sobreexposición del sellador al medio²³ permitiendo una reproducción más realista de las condiciones “in vivo”. Sin embargo, se aplicó una modificación menor debido al hecho de que los tejidos periapicales están en contacto con fluidos extracelulares, lo que disminuye la concentración del sellador²⁵. Por lo tanto, a la hora de comparar resultados, se debe tener en cuenta que las diferentes metodologías utilizadas en los ensayos de citotoxicidad, como el tipo de célula empleada^20,26 o el modelo utilizado²⁰, podría influir en los resultados. Hay que tener en cuenta, que los estudios “in vitro” no reproducen las condiciones dinámicas de los tejidos periapicales²⁷, por lo que se requieren nuevas investigaciones con modelos más complejos.

En el presente estudio, los medios acondicionados se comenzaron a recoger con los cementos recién mezclados. La evaluación de los selladores recién mezclados simula las condiciones clínicas²⁵ y permite la evaluación de los selladores durante el tiempo de fraguado, durante el cual, se podrían liberar subproductos¹⁷. Taraslia y cols.,²⁷ observaron en su estudio que la citotoxicidad fue significativamente superior grupos recién mezclados. Sin embargo, otros estudios analizan los cementos una vez han fraguado²².
En relación con el análisis de la toxicidad, todos los selladores presentaron una toxicidad decreciente durante los diferentes periodos de evaluación, lo que coincide con los resultados de los estudios anteriores para BioRoot® RCS, Nano-ceramic Sealer®¹⁵ y para AH Plus® ^28,29. Sin embargo, otras investigaciones mostraron un aumento de la citotoxicidad para BioRoot® RCS ^30,31 y AH Plus®^30-33.

Tras el análisis de las primeras 24 horas, el cemento Nano-ceramic Sealer® presentó mejor viabilidad celular. No se observaron diferencias entre AH Plus Jet® y BioRoot® RCS. Sin embargo, en otros estudios observaron mayor viabilidad para BioRoot® RCS que para el Nano-ceramic Sealer®¹⁵ y menos citotoxicidad para el BioRoot® RCS que para los cementos de resina^17,34. A las 48 horas, algunos estudios obtuvieron valores de viabilidad más bajos para BioRoot® RCS que para el grupo control^17,22. Finalmente, después de 72 horas, sólo el BioRoot® RCS presentó una ligera citotoxicidad. Sin embargo, Dimitrova-Nakov y cols.,¹⁴ no observaron ninguna diferencia en la viabilidad entre el BioRoot® RCS y el grupo de control.

La presencia de ciertos niveles de citotoxicidad podría depender de la solubilidad de los cementos³⁵. Zhang y cols.³⁶ observaron en cementos a base de silicato, que una ligera respuesta citotóxica del sellador iRoot® SP podría estar relacionada con el elevado pH de la superficie que causa la desnaturalización de las proteínas y células adyacentes. En relación con los cementos de resina, una mínima liberación de formaldehído que puede ser causada por las aminas de su composición, podría ser responsable de la presencia de una toxicidad inicial¹⁷.

En la literatura se han descrito reacciones inflamatorias transitorias al entrar en contacto el cemento sellador con los tejidos periapicales³⁷. Sin embargo, la interacción entre los cementos y las células que participan en la curación de los tejidos no es muy conocida³⁸. En presencia de cuerpos extraños, se reclutan diferentes líneas celulares como macrófagos derivados de monocitos, neutrófilos o linfocitos³⁹. Estas células promueven el proceso inflamatorio, secretando factores de crecimiento y citoquinas³⁹ como IL-1, IL-6, IL-8, prostaglandina E2 (PGE2 ) y óxido nítrico (NO)11. Además, las citoquinas también se expresan durante la infección bacteriana de la pulpa⁴⁰.

En relación con el análisis de la respuesta inflamatoria, en el presente trabajo se midió la citoquina inflamatoria IL-6 mediante el ensayo ELISA y los niveles de nitrito. El grupo BioRoot® RCS mostró una expresión de IL-6 en fibroblastos L132 a las 24, 48 y 72 horas, que disminuyó a lo largo del período de evaluación. En los cementos Nano-ceramic Sealer® y AH Plus Jet®, no se observó en ningún momento expresión de IL-6. Hay pocos estudios que evalúen la respuesta inflamatoria de los nuevos cementos de endodoncia a base de silicato. Jeanneau y cols.⁴¹ obtuvieron tras la estimulación de los fibroblastos, una disminución de la secreción de IL-6 con el BioRoot® RCS, pero un aumento de la secreción con el Pulp Canal Sealer. Los tres cementos presentaron una ausencia de niveles de nitrito, lo que elimina una posible fuente de inflamación, ya que las altas concentraciones pueden ser protóxicas e inflamatorias⁴².

El ligero aumento en los niveles de IL-6 que presentó el BioRoot® RCS, unido a la ligera citotoxicidad, podría desencadenar un proceso inflamatorio que podría ser positivo para el proceso de curación⁴⁰. Se necesitarían más estudios para evaluar otros aspectos del proceso inflamatorio, así como su evolución a lo largo del tiempo.

Todos los cementos selladores mostraron un cierto nivel de citotoxicidad, que disminuyó durante el periodo de evaluación. El cemento BioRoot® RCS fue el único que mantuvo un ligero nivel de citotoxicidad a las 72h de incubación y el único que desencadenó una respuesta inflamatoria. Se necesitan más estudios para evaluar la respuesta celular a los diferentes cementos a base de silicatos.

Agradecemos a la Universidad Europea el apoyo financiero de la investigación.